使用土壤硝酸還原酶測試盒測定的意義及操作方法

　　S-NR催化土壤中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，是土壤硝態氮還原的關鍵酶。研究S-NR的活性對合理施肥，降低氮素的損失具有重要意義。
 

　　測定原理
 

　　S-NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ+NADH+H+→NO2ˉ+NAD++H2O;產生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成紅色偶氮化合物;生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測定。
 

　　土壤硝酸還原酶測試盒的操作步驟:
 

　　實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解);試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。
 

　　1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
 

　　2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100μl(在使用前一小時內配制)，酶標板加上覆膜,37℃反應60分鐘。
 

　　3.溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
 

　　4.每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液)100μl，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。
 

　　5.溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
 

　　6.依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色(30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止)。
 

　　7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。